REPLICACION IN VITRO(PCR)

PCR

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la década de 1980.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores .

Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.

Todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción (ver más abajo). Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecían de este sistema, solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Para realizar la técnica se necesitan:

_Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

_Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

_Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg²⁺), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl₂), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn²⁺), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn²⁺ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.

_ Iones monovalentes, como el potasio.

_Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de el ADN polimerasa.

_ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).

_ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

_Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

  Ciclo de amplificación

Esquema general de la PCR.

Grado de amplificación según el número de ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto específico, 3: producto inespecífico); B concentración de ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la concentración de ADN respecto del tiempo.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar.

Actualmente, casi todos los termocicladores te dan la opción de realizar la reacción de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicará calor a la parte de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que no incluían este sistema tenían que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensación de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran dos fases:líquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso físico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.

 

Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

  Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

  Alineamiento o unión del cebador

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

  Extensión o elongación de la cadena

Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de el ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

  Elongación final

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

  Conservación

Este paso se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

  Optimización de la PCR

En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:

La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias, así que puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminación con ADN extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen espacialmente distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente. Por ejemplo, en laboratorios de detección genética, se suele hacer una división para la preparación de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR. Disponen también de cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades, y la lejía, las lámparas de UV y psoralenos son también muy recurridos para esta limpieza extensiva

Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la formación de productos falsos. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son:

Se recomienda usar primers de más de 15 nucleótidos (18-30 nn) Normalmente, se suelen diseñar de 20 nucleótidos. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción.

Los primers no deben diferir en más de 3 bases.

La proporción entre bases púricas y pirimidínicas de los dos oligos sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas.

Se requiere una distribución homogénea de los cuatro nucleótidos en la secuencia, evitando los poliT/A/G/C.

La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en más de 5ºC.

Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.

Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Las más habituales son la taq y la pfu.

Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas.

El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan más eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, además de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicación será clave.

https://www.google.com.mx/search?hl=es&q=PCR&bav=on.2,or.r_gc.r_pw.r_cp.r_qf.,cf.osb&biw=1600&bih=805&wrapid=tlif133192312414610&um=1&ie=UTF-8&tbm=isch&source=og&sa=N&tab=wi&ei=8opjT5ueB4OCsgKb_-2bCw

es.wikipedia.org/wiki/Reacción_en_cadena_de_la_polimerasa

CONTROL GENETICO DE LA REPLICACION

CONTROL GENETICO DE LAREPLICACION

El conjunto de procesos que ocurren durante el ciclo celular llevan un orden y supervisión estrictos.

Señales provenientes del medio y algunos controladores dentro de la célula, se encargan de dirigir el progreso de ésta a través de las distintas fases del ciclo celular. Entonces hablamos de que hay una regulación extracelular y una regulacion intracelular .

Regulación intracelular

El control interno del ciclo celular está a cargo de proteínas, cuyas acciones podrían resumirse en series de activaciones e inhibiciones de otras proteínas,que son indispensables durante las fases del ciclo. Los principales efectores de esta regulación, son dos: las proteínas que permiten el progreso del ciclo,1) los complejos cdk-ciclina y las proteínas que las inhiben, 2) dos pequeñas familias de proteínas, las CIP y las INK4.

Los complejos cdk-ciclina están compuestos por 2 tipos de proteínas, las cdk (cinasa dependiente de ciclina) y las ciclinas (que pasan por un ciclo de síntesis y degradación). Se conocen seis cdk pero sólo se ha caracterizado la función de cuatro de ellas (cdk 1, 2, 4 y 6) mientras que de las ciclinas sólo se conocen 4 tipos(ciclinas A, B, D y E). La cdk fosforila aminoácidos específicos de algunas proteínas, pero sólo si esta unida a una ciclina. Se conocen 6 distintas combinaciones de cdk-ciclina que actua en tiempos especificos durante el ciclo.

Se sabe que las células sintetizan proteínas inhibidoras de los complejos cdk-ciclinas, que colaboran al control del ciclo celular. Estas proteínas se han agrupado en dos: las proteínas INK4 (inhibidoras de cinasa 4) y las CIP (proteínas inhibidoras de cdk’s). Las INK4, se unen e inhiben sólo los complejos cdk4-ciclina D y cdk6-ciclina D, la única caracterizada es la p16 ( p= fosfoproteína y el número es su peso en kDa). Las CIP se unen e inhiben a todos los complejos que tengan cdk 1, 2, 4 y 6, actualmente se conocen las: p21, p27 y p53.

La p21 bloquea el ciclo celular en la transición G1/S, uniéndose a los complejos CDK4/ciclina D y CDK2/ciclina E, responsables de dicha transición. Esta parada del ciclo celular permite a la célula reparar el ADN dañado antes de replicarse. Cuando se daña el ADN, se provoca un incremento de la concentración y de la actividad de la proteína p53. Cuando se activa p53 se estimula la traducción de p21 (25,26).

La p27 regula señales inhibidoras del crecimiento y la inhibición por contacto (26).

La p57, a diferencia de la expresión ubicua de las proteínas p21 y p27, tiene una ruta de expresión tejido-específica, lo que sugiere un papel especializado en el control del ciclo celular (26).

La familia INK4 incluye cinco proteínas: p14, p15, p16, p18 y p19. A diferencia de las proteínas de la familia CIP/KIP, que se unen a complejos CDK/ciclina, la familia INK4 se une sólo a CDK en el sitio de unión de las ciclinas e inhiben específicamente CDK4 y CDK6, implicadas en el control de la fase G1.

http://www.biocancer.com/journal/1220/42-regulacion-negativa-del-ciclo-celular

REPLICACION EN EUCARIOTES

EUCARIONTES: MUCHOS ORÍGENES DE REPLICACIÓN. MÚLTIPLES REPLICONES.

La principal diferencia de la replicación de virus y bacterias con la replicación de eucariontes radica en que los eucariontes poseen muchos orígenes de replicación, probablemente debido a la enorme cantidad de ADN que poseen y a que su material hereditario en la inmensa mayoría de los casos esta repartido en varias moléculas de ADN distintas o varios cromosomas. Por tanto, los eucariontes tienen en cada cromosoma muchos orígenes de replicación, y como consecuencia, muchos replicones (unidades de replicación).

Esquema con múltiples orígenes de replicación	Muchos orígenes de   replicación en D. Melanogaster

DIRECCIÓN DE SÍNTESIS 5' - 3', BIDIRECCIONAL

Las ADN polimerasas de E.coli (las enzimas encargadas de sintetizar ADN) solamente saben sintetizar ADN en la dirección 5' - 3'. Es decir, solamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo 3' OH de otro nucleótido trifosfato. Las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que añadir nucleótidos trifosfato para comenzar la síntesis de ADN.

La replicación del ADN en E. coli es bidireccional, ya que a partir de un punto de origen progresa en dos direcciones opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicación. Cuando se mira solamente una de las horquillas de replicación, una de las hélices se sintetiza de forma continua, la hélice conductora (también llamada hélice líder), mientras que la otra hélice se sintetiza de manera discontinua, hélice retardada (también llamada hélice retrasada), a base de fragmentos cortos. Si se observan simultáneamente las dos horquillas de replicación, a un lado del origen la hélice de nueva síntesis se polimeriza de forma continua, mientras que al otro lado del origen se polimeriza de forma discontinua.

Para demostrar que la replicación es bidireccional se pueden realizar experimentos que se denominan de pulso y caza, en los que la célula es expuesta durante un breve periodo de tiempo en un medio con timidina tritiada TH³ (pulso) y después se pasa a un medio con timidina no radiactiva (fría) en exceso (caza). Posteriormente se extiende el ADN se un portaobjetos y después se realiza una autorradiografía.

Replicación bidireccional: Experimento de pulso y caza

SEMIDISCONTINUA, FRAGMENTOS DE OKAZAKI

Debido al antiparalelismo de las dos hélices del ADN y a que las ADN polimerasas solamente saben sintetiza ADN en la dirección 5'P - 3'OH, la síntesis de una de las hebras se puede realizar de forma continua, mientras que la otra hélice para poder sintetizarla al mismo tiempo se necesita polimerizarla a base de ir añadiendo pequeños fragmentos (fragmentos o piezas de Okazaki). Como una hélice se sintetiza de forma continua y la otra lo hace de forma discontinua, se dice que la Replicación es Semidiscontinua.

INICIACIÓN MEDIANTE ARN CEBADOR

Como ya hemos dicho anteriormente, las ADN polimerasas solamente saben sintetizar ADN en la dirección 5' - 3' añadiendo nucleótidos al extremo 3' OH de otro nucleótido. Para que puedan iniciar la síntesis de ADN necesitan un extremo 3' OH al que ir añadiendo nucleótidos, y ese extremo 3' OH lo suministra un ARN de pequeño tamaño alrededor de 25 a 30 ribonucleótidos que se denomina ARN cebador o "primer".

La síntesis de ADN comienza, por tanto, sintetizando un corto segmento de ARN denominado cebador, dicho cebador lo sintetiza un enzima denominado Primasa. La Primasa es una ARN polimerasa que utiliza como molde ADN. Todos los fragmentos de Okazaki comienzan por un Cebador. Posteriormente, la Holoenzima de ADN polimerasa III lleva a cabo la síntesis del fragmento de ADN correspondiente hasta llegar al siguiente cebador. En ese momento, la ADN polimerasa I sustituye a la Holoenzima de ADN polimerasa III. La ADN polimerasa I se encarga de retirar el ARN cebador mediante su actividad exonueótídica 5'P - 3' OH y al mismo tiempo rellena el hueco sintetizando ADN.

Por último, los dos fragmentos de Okazaki tienen que unirse, es necesario enlazar el extremo 3'OH de un fragmento con el 5'P del siguiente fragmento. Dicha labor de sellado y unión de los sucesivos fragmentos la realiza la Ligasa.

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

Replicación en procariontes.

Ocurre en tres etapas:

1ª etapa: desenrrollamiento y apertura de la doble hélice.en el punto ori.

En el punto de origen u ORI, que es un lugar del cromosoma con gran contenido de A y T, la doble hélice se abre, mediante la DNA helicasa y las proteínas desestabilizadoras de la hélice o proteínas de unión a DNA de una sola cadena, vuelven recta la cromatina y la mantienen abierta. La DNA polimerasa sintetiza las cadenas complementarias a cada una de las cadenas primitivas. Forma dos copias activas de ADN, una es continua, o sea, basta con agregar los nucleotidos correspondientes porque la hebra antigua tiene 3', por lo que se crea una 5´. En la otra hebra, se produce un proceso discontinuo, debido a que la hebra quedo con un final 5', debiendo partir con un 3', y la célula es incapaz de seguir la cadena con este final, para que se inicie la copia del DNA hace falta un corto RNA específico (10 pares de bases), denominado RNA cebador, que hace que empiece a actuar la DNA polimerasa. El RNA cebador es generado por la RNA primasa (sintetizadora de RNA). Esta enzima se une directamente a la DNA helicasa, formando un complejo llamada primosoma, que se va desplazando con la cadena en formación. Conforme van existiendo fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se va sintetizando la cadena discontinua formando pequeños fragmentos, denominados Fragmentos de Okazaki, cada uno de unos 1000 nucleótidos. . Hace falta un RNA cebador por cada fragmento de Okazaki. La RNA primasa, va sintezando a intervalos los RNA cebadores que van siendo incorporados a la copia como si fueran ADN, entre los fragmentos de Okazaki, hasta que se alcanza el RNA cebador del fragmento de Okazaki ya terminado. . La cadena con ARN cebador, es denominada cadena retrasada.

El DNA sintetizado en la cadena retrasada y su cadena patrón sufren un plegamiento, de tal forma que la DNA polimerasa de la cadena conductora se unen para formar un complejo único, de modo que las proteínas de replicación puedan utilizarse conjuntamente en la replicación de ambas cadenas. Las topoisomerasas mantienen esta estructura y evitan que el DNA se enrede por superenrrollamiento, cortando un enlace fosfodiester, y a esto se le llama nick.Además, existe una proteína llamada SSB, que estabiliza la forma monocatenaria de la hebra en replicación, para que no se acople por complementariedad de bases con ella misma.

Las enzimas ligasas son las encargadas, despues, de ir arreglando los nicks cuando se sustituye el ARN cebador.

Exiten tres tipos de ADN-polimerasa, la I, es la encarga de reparar la hebra; la II, de ayudar a la III; y la III, agrega las bases a la hebra.

La labor de la ADN-pol I es exonucleasa, puede poner bases como sacar bases, con esto puede reparar la hebra. El dominio de esta proteína encargado de incluir bases a la hebra se llama Fragmento Klenow, que puede ser liberado del resto de la proteína por la Tripsina.

http://www.angelfire.com/bc2/biologia/adn2.htm

REPLICACION DEL ADN

4.1 REPLICACION DEL ADN 

El significado genético de la replicación es el de conservar la información genética.  La estructura del ADN  en doble hélice permite comprender como dicha molécula puede dar lugar a copias sin perder su conformación.  En principio, las dos hebras  deberían separarse. Después, mediante la acción de otra enzima, a partir de desoxirribonucleótidos sueltos y según la complementariedad de bases, podría irse 

construyendo las hebras complementarias de las dos hebras “modelo” iniciales.

La replicación del ADN produce una copia de sí mismo por medio de enzimas que además de ser muy exactas poseen un sistema de reparación de errores. El mecanismo de replicación es es esencialmente el mismo en todas las células. Es un proceso semiconservativo porque cada uno de los dos ADN hijos tiene una cadena del ADN anterior.

http://bernardoalonzo.bligoo.com.mx/media/users/14/708943/files/96166/Replicaci_C3_B3n_del_ADN.pdf 

http://www.google.com/imgres?um=1&hl=es&sa=N&biw=1280&bih=933&tbm=isch&tbnid=ZluD1ShxVjyawM:&imgrefurl=http://es.wikipedia.org/wiki/Replicaci%25C3%25B3n_de_ADN&docid=6H14uOLAjEb_QM&imgurl=http://upload.wikimedia.org

experimento de Meselson-Stahl

El experimento de Meselson-Stahl fue un experimento realizado en 1957 por Matthew Meselson y Franklin Stahl en el que se demostró que la replicación de ADN era semiconservadora. Una replicación semiconservadora es aquella en que la cadena de dos filamentos en hélice del ADN se replica de forma tal que cada una de las dos cadenas de ADN formadas consisten en un filamento proveniente de la hélice original y un filamento nuevo sintetizado.

El experimento permitió confirmar las teorías de James Watson y de Francis Crick sobre el método de replicación del ADN.

Para investigar la forma de replicación del ADN, Meselsohn y Stahl idearon una forma muy ingeniosa que se basa en dos premisas fundamentales, por una parte está el hecho de que el nitrógeno es uno de los principales elementos del ADN, y por la otra el nitrógeno posee dos isótopos que pueden ser distinguidos mediante técnicas de laboratorio.

Aunque el ¹⁴N es el isótopo más abundante del nitrógeno, el ADN es también viable con el isótopo ¹⁵N el cual es más pesado. El isótopo ¹⁵N no es radioactivo, solo es más pesado que el nitrógeno común.

De esta forma Meselsohn y Stahl mediante un inteligente planteo del experimento, en el que utilizaron bacterias y observaron cómo replicaban su ADN, pudieron obtener información que les permitió identificar el mecanismo de replicación del ADN y descartar ciertas teorías alternativas.

 

Se realizó un cultivo de E. coli durante varias generaciones en un medio con ¹⁵N. Al extraer ADN de estas células y centrifugarlo en un gradiente de cloruro de cesio, las moléculas de ADN se situaban en el punto donde su densidad igualaba la del medio. El ADN de estas células tenía una mayor densidad que el de otras cultivadas con ¹⁴N. Posteriormente, las células de E. coli que sólo contenían ¹⁵N en su ADN se colocaron en un medio con ¹⁴N y se les permitió que se replicaran una sola vez. Se extrajo el ADN de estas células y se comparó con el preparado con ¹⁴N y con el preparado con ¹⁵N, encontrando que su densidad era prácticamente el promedio. Dado que una replicación conservadora hubiera producido iguales cantidades de ADN de mayor y menor densidad (pero sin producir ADN de una densidad intermedia), se descartó que la replicación siguiera el mecanismo conservador. Sin embargo, este resultado era consistente tanto con una replicación semiconservadora como con una de tipo dispersante. Una replicación semiconservadora hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN donde un filamento tiene ¹⁵N mientras que el otro filamento tiene ¹⁴N, mientras que una replicación dispersante hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN con ambos filamentos conteniendo mezclas de ¹⁵N y ¹⁴N; en ambos casos la densidad del ADN tendría un valor promedio entre las densidades de los ADN de ¹⁵N y ¹⁴N.

Se extrajo ADN de células que habían crecido por varias generaciones en un medio con ¹⁵N, y a las que se les había permitido que realizaran dos replicaciones en un medio con ¹⁴N. Al analizar estas células se encontró que contenían cantidades iguales de ADN con dos densidades distintas, una igual a la obtenida tras una sola replicación en un medio con ¹⁴N, mientras que la otra correspondía al ADN producido exclusivamente con ¹⁴N. Este resultado era claramente inconsistente con una replicación dispersante, que hubiera dado como producto ADN con una densidad única e inferior a la de una sola generación, pero mayor que la de ¹⁴N, ya que el ADN original con ¹⁵N se habría repartido de forma uniforme entre todos los filamentos de ADN. Este resultado era consistente con una replicación semiconservadora, en cuanto a que la mitad del ADN de segunda generación tiene un filamento original con ¹⁵N y otro con ¹⁴N, lo que da como resultado un ADN con una densidad intermedia, mientras que la otra mitad del ADN contiene en su totalidad ¹⁴N --un filamento sintetizado en la primera división y otro en la segunda división. Este descubrimiento fue sumamente importante en el desarrollo de la biología y es de gran ayuda en la investigación y tratamiento de enfermedades .

Las figuras siguientes ilustran el experimento Meselson y Stahl que demostró lo correcto del modelo semiconservativo de la replicación del ADN. Usted será capaz de "correr" la centrifugación del CsCl ( cloruro de cesio) y ver la banda o bandas del ADN para cada condición de cultivo (el tubo derecho en cada caso), comparado con la banda control, marcada como 14N (ligera) del ADN ( tubo izquierdo). Haga Click sobre cada tubo de muestreo de ADN para correr la centrifugación. Haga Click sobre "de cerca" para más información sobre el Cloruro de Cesio.

1. Las bacterias crecen en el medio 14N o 15N.
2. Muestras removidas y el ADN extraído.
3. Centrifugue las muestras de ADN haciendo click en los tubos de muestra de ADN de abajo.

Meselson y Stahl probaron la hipótesis de la replicación del ADN. Ellos cultivaron bacterias en un medio 15N. El 15N es un isótopo pesado de nitrógeno, por lo tanto el ADN sintetizado es de densidad pesada. Ellos entonces cambiaron las bacterias al medio 14N. El ADN se aisló diferentes veces que corresponden a los ciclos de replicación 0, 1, y 2. Después de un ciclo de replicación, el ADN fue todo de densidad intermedia. Esto descarta el modelo conservador de la replicación, que predice que ambos ADN (pesado y liviano) estarán presentes, pero ninguno de densidad intermedia estará presente. Este resultado es consistente con el modelo semiconservativo de replicación, que predice que todas las moléculas de ADN consistirán de una cadena 15N de ADN y una cadena 14N de ADN. El resultado no descarta el modelo dispersivo de replicación, que también predice que todo el ADN será de densidad intermedia, consistiendo de segmentos intercalados de doble cadena 15N y 14N. Después de dos ciclos de replicación, se ven dos bandas de ADN, una de densidad intermedia y una de densidad liviana. Este resultado es exactamente lo que el modelo semiconservativo predice: la mitad debería ser densidad intermedia 15N-14N la intermedia y la mitad de densidad liviana 14N-14N. Este resultado descarta el modelo dispersivo de la replicación, que predice que después del ciclo 1 de replicación, la densidad del todas las moléculas de ADN, gradualmente llegarían a ser más bajas. Por lo tanto, ningún ADN de densidad intermedia intermedio debería permanecer después del ciclo 2. El modelo semiconservativo es correcto.

http://www.maph49.galeon.com/adn/experiment.html

                               INTRODUCCION 

El proceso de replicación de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). De esta manera de una molécula de ADN única, se obtienen dos o más "clones" de la primera. Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble helicecontiene una de las cadenas de ADN  original. Gracias a la complementariedad entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una celula madre a las celulas hijas y es la base de la herencia del material genético.

La molecula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrogeno entre las bases complementarias liberándose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria añadiendo nucleótidos que se encuentran dispersos en el núcleo. De esta forma, cada nueva molécula es idéntica a la molécula de ADN inicial.

La replicación empieza en puntos determinados: los orígenes de replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicacion . Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de replicación o replisoma. Estas proteínas y enzimas son homólogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias.

semiconservadora

Tres posibles modelos de replicación. a) Conservadora, b) Dispersora, c) Semiconservadora (mecanismo real)

En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales, y por eso se dice que la replicación del ADN es semiconservadora. Hasta que finalmente se pudo demostrar que la replicación es semiconservadora, se consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicación:

• Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales.
• Conservadora. Se sintetiza una molécula totalmente nueva, copia de la original.
• Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva.

Experimento de Meselson y Stahl.

El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permitió demostrar que el mecanismo real se ajusta a la hipótesis de replicación semiconservadora. Para ello se hicieron crecer células de Escherichia coli en presencia de nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo habitual. En consecuencia, el isótopo se incorporó a las cadenas de ADN que se iban sintetizando, haciéndolas más pesadas.

Una vez conseguido el primer objetivo, las células fueron transferidas a un medio que contenía nitrógeno-14, es decir, un medio más ligero, donde continuaron su crecimiento (división celular, que requiere la replicación del ADN). Se purificó el ADN y se analizó mediante una centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay más densidad en el fondo del tubo que en la parte media del mismo.

En la primera generación (figura 2.b) se obtuvo una única banda de ADN con densidad intermedia. En la segunda generación (figura 2.c) se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra con densidad intermedia o híbrida. En la tercera generación se obtuvieron dos bandas, una ligera (con una abundancia del 75%) y otra intermedia (con el 25% restante).

La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena pesada (original) y otra ligera (recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no existían aun cuando las células se pusieron en presencia de nitrógeno-15.

El hecho de que cada vez haya más moléculas ligeras y se mantenga el número de moléculas intermedias demuestra que la replicación del ADN es semiconservadora. Si fuera conservadora, aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) . Si fuera dispersante sólo aparecerían bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.

Secuencial y bidireccional desde puntos fijos.

Los orígenes de replicación son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. Por otro lado, la replicación se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.

El origen de replicación

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se denomina replicón o unidad funcional de replicación. El genoma bacteriano es un replicón único circular. Enorganismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples orígenes a la vez (hay uno cada 20kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.

Experimento de Cairns

Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicación a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistían en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contenía timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografía. A continuación se observaba almicroscopio. Los resultados indicaban que la replicación en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).

Secuencialidad

Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos de complementación de mutaciones que permitieron determinar que desde los orígenes la replicación avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las células del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular. El método consistía en la conjugación bacteriana de cepas silvestres con cepas mutantes incapaces de sintetizar determinados aminoácidos. Conociendo la localización de los genes que codifican las proteínas implicadas en la síntesis de los diferentes aminoácidos en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias receptoras en un "medio mínimo" (donde sólo pudiesen crecer las que hubieran recibido alguno de estos genes), al extraer ADN a diferentes tiempos se observó que, tras la última extracción aparecía con mayor frecuencia el gen implicado en la síntesis de uno de los aminoácidos (el correspondiente a la "posición 1"), que el gen adyacente implicado en la síntesis de otro aminoácido ("posición 2"). De la misma forma, el gen que ocupaba la "posición 3" aparecía con menor frecuencia que el que ocupaba la "posición 2", y así sucesivamente.

Como los primeros genes en replicarse en la bacteria donadora serían los primeros en transferirse, el experimento permitió demostrar, a partir de las frecuencias relativas de los diferentes genes en las bacterias receptoras, que la replicación sigue un orden (es secuencial).

La replicación avanza en forma de horquilla

Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo tiempo, éstas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla formándose una burbuja u ojo de replicación (también llamada estructura θ cuando el ADN es circular debido a la similaridad entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma bacteriano en estados intermedios de replicación, no obstante pudiendo aparecer estructuras alternativas), que avanza en dirección a la región de ADN no duplicado dejando atrás los dos moldes de ADN de cadena simple donde se está produciendo la replicación.

Bidireccionalidad

El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayoría de los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicación que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o monocatenario).Así, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plásmidos y algunos genomas monocatenarios de fagos pequeños, la replicación se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orígenes de replicación.

Distinción entre la replicación unidireccional y la bidireccional mediante el recuento de copias de genes marcadores. O es el origen de replicación y A, B, C, D, E son genes marcadores.

En la mayoría de los casos la replicación es bidireccional

No obstante, la replicación se puede considerar, de forma general, bidireccional.

La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una técnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con tritio. Primero se añade timidina marcada y luego sin marcar, y siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dónde se ha replicado la molécula de ADN.También se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicación es unidireccional o bidireccional. Otras técnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicación hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restricción).

Semidiscontinua

La replicación es semidiscontínua

La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongación del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultáneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.

Este problema lo resolvieron los científicos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki en la década de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y 2000 nucleótidos en las bacteriasy entre 100 y 400 nucleótidos en eucariontes.

La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de replicación se denomina hebra adelantada (en inglés, leading strand, que a veces se traduce por líder o conductora) y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al avance se denomina hebra rezagada o retrasada (en inglés, lagging strand), cuya síntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la horquilla de replicación avance para disponer de una cierta longitud de ADN molde.²

]ADN Polimerasas

La ADN polimerasa es la enzima que cataliza la síntesis de la nueva cadena de ADN a partir dedesoxirribonucleótidos y de la molécula de ADN plantilla o molde que es la que será replicada. La enzima copia la cadena de nucleótidos de forma complementaria (A por T, C por G) para dar a cada célula hija una copia del ADN durante la replicación.Estructura en 3D de un ADN polimerasa

Modo de operación

En cada horquilla de replicación, la ADN polimerasa y otras enzimas sintetizan dos nuevas cadenas de ADN que son complementarias respecto a las 2 cadenas originales. Durante este proceso, la ADN polimerasa reconoce una base nucleotídica no apareada de la cadena original y la combina con un nucleótido libre que tiene la base complementaria correcta. Luego, la ADN polimerasa cataliza la formación de nuevos enlaces covalentes que ligan el fosfato del nucleótido libre entrante con el azúcar del nucleótido previamente agregado en la cadena hija en crecimiento. De esta forma, la ADN polimerasa sintetiza el esqueleto de azúcar-fosfato de la cadena hija.

Función correctora exonucleasa 3' → 5' de las ADN polimerasas.

Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el proceso de replicación. Además de participar en la elongación, desempeñan una función correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de éste. Es importante que existan estos mecanismos de corrección ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a mutaciones.

Proceso general

• La helicasa rompe los puentes de hidrógeno de la doble hélice permitiendo el avance de la horquilla de replicación.

• La topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento producido por la separación de la doble hélice.

• Las proteínas SSB se unen la hebra discontínua de ADN, impidiendo que ésta se una consigo misma.

• La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de forma discontínua en la hebra rezagada.

• La ARN primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la síntesis de la cadena complementaria a la cadena rezagada.

• La ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki.

El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciación, elongación y terminación.

• El cebador: son pequeñas unidades de RNA que se unen a los fragmentos para que la ADN polimerasa reconozca donde debe unirse.

Los cebadores los quita la pol. I y coloca bases a la cadena en crecimiento por la ligasa.

Iniciación

Mediante consumo de  ATP en dirección a la horquilla de replicación, es decir, en dirección 5' → 3' en la hebra rezagada y 3' → 5' en la hebra adelantada, rompiendo los puentes de hidrogeno que mantienen unida la doble helice.El siguiente conjunto de proteínas reclutadas son las denominadas proteínas SSB (single-stranded DNA binding proteins, proteínas ligantes de ADN monocatenario) encargadas de la estabilización del ADN monocatenario generado por la acción de las helicasas, impidiendo así que el ADN se renaturalice o forme de nuevo la doble hélice, de manera que pueda servir de molde. Estas proteínas se unen de forma cooperativa, por lo que su unión al DNA conforme avanza la helicasa es rápida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando superenrrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si éstos no fueran eliminados, llegado a un punto el replisoma ya no podría seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasándolas a través de la rotura realizada, sellando a continuación la brecha.

Elongación

Enzimas que participan en la replicación de E. coli: helicasa, proteínas SSB, topoisomerasa, ARN primasa, Holoenzima ADN Pol III

En el siguiente paso, la holoenzima ADN polimerasa cataliza la síntesis de las nuevas cadenas añadiendo nucleotidos sobre el molde. Esta síntesis se da bidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicacion  que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado.

Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN polimerasacatalice la formación de un fragmento corto específico de ARN llamado cebador, que determinará el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. Así, durante la síntesis, en cada horquilla de replicación se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciación, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que sólo es capaz de sintetizar en sentido 5´ → 3', la replicación sólo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de okazaki

La mitad del dimero  de la holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada.

Hebra rezagada: síntesis de cebadores, unión de fragmentos de Okazaki y eliminación de los cebador

En la eliminación del fragmento de Okazaki (también denominado iniciador, cebador o primer) intervienen dos de enzimas: por un lado la ADN Pol I, que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa 5' → 3' y simultáneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5' → 3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura (o "mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por último, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reacción de condensación entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo, completando el enlace fosfodiéster; para ello, es preciso hidrolizar una molécula de ATP.En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otrofragmento de Okazaki contiguo, el cebadorde ARN de éste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hélice de ADN. La eliminación de cebadores también se da en la hebra conductora, de síntesis continua, pero debido a que en ésta hay un solo cebador es un proceso que sólo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces como fragmentos de Okazaki haya.

Nota: diversos autores difieren en los enzimas implicados en esta etapa. Para algunos no es la propia ADN Pol I la que rellena el hueco tras eliminar el primer, sino que lo hace la ADN Pol III (la misma que polimeriza el resto de la cadena). Del mismo modo, algunos autores siguen empleando el término ribonucleasa para referirse a la ADN Pol I en esta etapa, ya que hasta hace poco se desconocía que la propia ADN Pol I tenía la capacidad exonucleasa 5' → 3, y se pensaba que esto lo realizaba otro enzima, que recibía este nombre genérico.

Terminación de los genomas lineales

El final de la replicación se produce cuando la ADN polimerasa III se encuentra con una secuencia de terminación. Se produce entonces el desacople de todo el replisoma y la finalización de la replicación.