PCR
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por
sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es
una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un
mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o
molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que
tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre
el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se
convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del
equipo necesario para llevarla a cabo.
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para
replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a
continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a
duplicarlas. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary
Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la década de
1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al
realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas
en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la
inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas
termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas
temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos
microorganismos, generalmente arqueas,
son: Thermus
aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent) y Thermus
termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy
procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores .
Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.
Todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado
termociclador, que permite
calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria
para cada etapa de la reacción (ver más abajo). Muchos termocicladores modernos
hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como
enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos
usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo
que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los
termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de
evitar la condensación
sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecían de
este sistema, solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de
reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en
laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de
aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis
funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la
identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses test de
paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Para realizar la técnica se necesitan:
_Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
_Dos cebadores o
iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada uno,
complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre
seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que permiten que la
polimerasa inicie la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha
distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los
nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
_Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado
comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o
algún otro catión divalente.
También se puede emplear manganeso
(Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas
concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la
síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.
_ Iones monovalentes, como el potasio.
_Una solución tampón (buffer)
que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de el ADN polimerasa.
_ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima
alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).
_ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
_Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada
una de las etapas que conforman un ciclo.
Ciclo de amplificación
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios
repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3
pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen
tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un
choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por
otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve
almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen
de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis
de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la
temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea
amplificar.
Actualmente, casi todos los termocicladores te dan la opción de realizar la
reacción de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del
termociclador aplicará calor a la parte de arriba del vial que contiene la
mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros
aparatos que se comercializaron y que no incluían este sistema tenían que poner
unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este procedimiento, al
igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensación de la muestra, ya
que en el eppendorf se encuentran dos fases:líquido y gas. Al condensarse la
muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o
poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso físico, conservando casi
intacto el volumen de la muestra.
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
Alineamiento o unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
Extensión o elongación de la cadena
Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de
nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a
la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo
el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra
de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de
el ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima
actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende
tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se
va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la
polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.
Elongación final
Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
Conservación
Este paso se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para
conservar la reacción a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en
pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se
emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de
ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y
dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis
en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida,
para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a
marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.
El/los tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador
de peso molecular de
ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el
gel junto con los productos de PCR.
Optimización de la PCR
En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima
cantidad de ADN para obtener un gran número de copias, así que puede ser muy
propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad,
que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a
analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminación con ADN
extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen
espacialmente distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de
trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente. Por ejemplo, en
laboratorios de detección genética, se suele hacer una división para la
preparación de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro donde
se encuentra la maquinaria para realizar la PCR. Disponen también de cabinas de
seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades,
y la lejía, las lámparas de UV y psoralenos son también muy recurridos para esta
limpieza extensiva
Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la
obtención de productos de PCR y en evitar la formación de productos falsos.
Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son:
Se recomienda usar primers de más de 15 nucleótidos (18-30 nn) Normalmente,
se suelen diseñar de 20 nucleótidos. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra
PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos
rendimiento en la reacción.
Los primers no deben diferir en más de 3 bases.
La proporción entre bases púricas y pirimidínicas de los dos
oligos sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases
púricas.
Se requiere una distribución homogénea de los cuatro nucleótidos en la
secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en más de 5ºC.
Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean
complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.
Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que
más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades
inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan en
intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden
funcionalidad. Las más habituales son la taq y la pfu.
Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de
nuestras enzimas.
El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente
los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecerán
termocicladores elaborados con materiales que hagan más eficaces el desarrollo y
el transcurso de las etapas, además de diversas facilidades de manejo. Dentro
del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicación será clave.
es.wikipedia.org/wiki/Reacción_en_cadena_de_la_polimerasa
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