experimento de Meselson-Stahl

El experimento de Meselson-Stahl fue un experimento realizado en 1957 por Matthew Meselson y Franklin Stahl en el que se demostró que la replicación de ADN era semiconservadora. Una replicación semiconservadora es aquella en que la cadena de dos filamentos en hélice del ADN se replica de forma tal que cada una de las dos cadenas de ADN formadas consisten en un filamento proveniente de la hélice original y un filamento nuevo sintetizado.

El experimento permitió confirmar las teorías de James Watson y de Francis Crick sobre el método de replicación del ADN.

Para investigar la forma de replicación del ADN, Meselsohn y Stahl idearon una forma muy ingeniosa que se basa en dos premisas fundamentales, por una parte está el hecho de que el nitrógeno es uno de los principales elementos del ADN, y por la otra el nitrógeno posee dos isótopos que pueden ser distinguidos mediante técnicas de laboratorio.

Aunque el ¹⁴N es el isótopo más abundante del nitrógeno, el ADN es también viable con el isótopo ¹⁵N el cual es más pesado. El isótopo ¹⁵N no es radioactivo, solo es más pesado que el nitrógeno común.

De esta forma Meselsohn y Stahl mediante un inteligente planteo del experimento, en el que utilizaron bacterias y observaron cómo replicaban su ADN, pudieron obtener información que les permitió identificar el mecanismo de replicación del ADN y descartar ciertas teorías alternativas.

 

Se realizó un cultivo de E. coli durante varias generaciones en un medio con ¹⁵N. Al extraer ADN de estas células y centrifugarlo en un gradiente de cloruro de cesio, las moléculas de ADN se situaban en el punto donde su densidad igualaba la del medio. El ADN de estas células tenía una mayor densidad que el de otras cultivadas con ¹⁴N. Posteriormente, las células de E. coli que sólo contenían ¹⁵N en su ADN se colocaron en un medio con ¹⁴N y se les permitió que se replicaran una sola vez. Se extrajo el ADN de estas células y se comparó con el preparado con ¹⁴N y con el preparado con ¹⁵N, encontrando que su densidad era prácticamente el promedio. Dado que una replicación conservadora hubiera producido iguales cantidades de ADN de mayor y menor densidad (pero sin producir ADN de una densidad intermedia), se descartó que la replicación siguiera el mecanismo conservador. Sin embargo, este resultado era consistente tanto con una replicación semiconservadora como con una de tipo dispersante. Una replicación semiconservadora hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN donde un filamento tiene ¹⁵N mientras que el otro filamento tiene ¹⁴N, mientras que una replicación dispersante hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN con ambos filamentos conteniendo mezclas de ¹⁵N y ¹⁴N; en ambos casos la densidad del ADN tendría un valor promedio entre las densidades de los ADN de ¹⁵N y ¹⁴N.

Se extrajo ADN de células que habían crecido por varias generaciones en un medio con ¹⁵N, y a las que se les había permitido que realizaran dos replicaciones en un medio con ¹⁴N. Al analizar estas células se encontró que contenían cantidades iguales de ADN con dos densidades distintas, una igual a la obtenida tras una sola replicación en un medio con ¹⁴N, mientras que la otra correspondía al ADN producido exclusivamente con ¹⁴N. Este resultado era claramente inconsistente con una replicación dispersante, que hubiera dado como producto ADN con una densidad única e inferior a la de una sola generación, pero mayor que la de ¹⁴N, ya que el ADN original con ¹⁵N se habría repartido de forma uniforme entre todos los filamentos de ADN. Este resultado era consistente con una replicación semiconservadora, en cuanto a que la mitad del ADN de segunda generación tiene un filamento original con ¹⁵N y otro con ¹⁴N, lo que da como resultado un ADN con una densidad intermedia, mientras que la otra mitad del ADN contiene en su totalidad ¹⁴N --un filamento sintetizado en la primera división y otro en la segunda división. Este descubrimiento fue sumamente importante en el desarrollo de la biología y es de gran ayuda en la investigación y tratamiento de enfermedades .

Las figuras siguientes ilustran el experimento Meselson y Stahl que demostró lo correcto del modelo semiconservativo de la replicación del ADN. Usted será capaz de "correr" la centrifugación del CsCl ( cloruro de cesio) y ver la banda o bandas del ADN para cada condición de cultivo (el tubo derecho en cada caso), comparado con la banda control, marcada como 14N (ligera) del ADN ( tubo izquierdo). Haga Click sobre cada tubo de muestreo de ADN para correr la centrifugación. Haga Click sobre "de cerca" para más información sobre el Cloruro de Cesio.

1. Las bacterias crecen en el medio 14N o 15N.
2. Muestras removidas y el ADN extraído.
3. Centrifugue las muestras de ADN haciendo click en los tubos de muestra de ADN de abajo.

Meselson y Stahl probaron la hipótesis de la replicación del ADN. Ellos cultivaron bacterias en un medio 15N. El 15N es un isótopo pesado de nitrógeno, por lo tanto el ADN sintetizado es de densidad pesada. Ellos entonces cambiaron las bacterias al medio 14N. El ADN se aisló diferentes veces que corresponden a los ciclos de replicación 0, 1, y 2. Después de un ciclo de replicación, el ADN fue todo de densidad intermedia. Esto descarta el modelo conservador de la replicación, que predice que ambos ADN (pesado y liviano) estarán presentes, pero ninguno de densidad intermedia estará presente. Este resultado es consistente con el modelo semiconservativo de replicación, que predice que todas las moléculas de ADN consistirán de una cadena 15N de ADN y una cadena 14N de ADN. El resultado no descarta el modelo dispersivo de replicación, que también predice que todo el ADN será de densidad intermedia, consistiendo de segmentos intercalados de doble cadena 15N y 14N. Después de dos ciclos de replicación, se ven dos bandas de ADN, una de densidad intermedia y una de densidad liviana. Este resultado es exactamente lo que el modelo semiconservativo predice: la mitad debería ser densidad intermedia 15N-14N la intermedia y la mitad de densidad liviana 14N-14N. Este resultado descarta el modelo dispersivo de la replicación, que predice que después del ciclo 1 de replicación, la densidad del todas las moléculas de ADN, gradualmente llegarían a ser más bajas. Por lo tanto, ningún ADN de densidad intermedia intermedio debería permanecer después del ciclo 2. El modelo semiconservativo es correcto.

http://www.maph49.galeon.com/adn/experiment.html